Il plasma atmosferico freddo (CAP) è una tecnologia promettente contro diversi tipi di cancro. Tuttavia, i risultati attuali sull'effetto della PAC sulle colture di glioblastoma bidimensionale non considerano il ruolo del microambiente tumorale. Lo scopo di questo studio era di determinare la capacità della PAC di ridurre e controllare i tumori di glioblastoma sferoide in vitro. I tumori tridimensionali di glioblastoma sferoide (U87-Red, U251-Red) sono stati trattati consecutivamente direttamente e indirettamente con un CAP utilizzando He, He + 5% H 2 O o He + 20% H 2 O. La citotossicità e il restringimento sferoide erano monitorato usando l'imaging live. Le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto prodotte in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sono state misurate mediante risonanza paramagnetica (EPR) e colorimetria elettronica. È stata anche valutata la migrazione cellulare. I nostri risultati dimostrano che i trattamenti CAP successivi (He + 20% H 2 O) riducono sostanzialmente gli sferoidi U87-Red e, in misura minore, gli sferoidi U251-Red. L'effetto citotossico era dovuto alle specie a breve e lunga vita prodotte dalla PAC: hanno inibito la crescita sferoidale, ridotto la migrazione cellulare e diminuito la proliferazione negli sferoidi trattati con CAP. I trattamenti diretti erano più efficaci dei trattamenti indiretti, suggerendo l'importanza delle specie a vita breve generate dalla PAC per l'inibizione della crescita e la citotossicità cellulare dei tumori di glioblastoma solido. Abbiamo concluso che il trattamento con la PAC può ridurre efficacemente la dimensione del tumore di glioblastoma e limitare la migrazione cellulare, dimostrando così il potenziale delle terapie CAP per il glioblastoma.
parole chiave:
cancro; plasma atmosferico freddo (CAP); restringimento sferoide;citotossicità; riduzione del tumore; glioblastoma; specie reattive di breve durata;migrazione cellulare; proliferazione1. Introduzione
Glioblastoma multiforme (GBM) è una neoplasia altamente aggressiva e il tumore aggressivo più comune sul sistema nervoso centrale nella popolazione adulta [ 1 ]. Le attuali terapie contro il GBM comprendono la massima resezione chirurgica, radioterapia e chemioterapia. Tuttavia, la recidiva del tumore è molto comune, il che contribuisce allo scarso tasso di sopravvivenza dopo la diagnosi (sopravvivenza mediana di 15 mesi, sopravvivenza a 5 anni inferiore al 5%) [ 2 , 3 ]. Nonostante i significativi miglioramenti nel trattamento del cancro, il GBM rimane una neoplasia incurabile.
I plasmi atmosferici freddi (PAC) sono attualmente in fase di studio a causa delle loro proprietà anti-cancro [ 4 , 5 ]. I componenti chimici prodotti dalle CAP, identificati come agenti attivi responsabili degli effetti biologici, sono stati ampiamente studiati [ 6 , 7 ]. Le specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (RONS) generate e trasportate dal plasma causano danni funzionali e strutturali ai lipidi nelle membrane cellulari [ 8 ], ossidano le proteine [ 9 ], inducono rotture del DNA [ 10 ] e promuovono la morte cellulare con meccanismi diversi [ 11 ] 12 ]. Al contrario, i componenti fisici prodotti da plasma come i fotoni UV e i campi elettromagnetici da soli hanno un impatto cellulare trascurabile [ 13 ]. Inoltre, è stato suggerito che la CAP è selettiva verso le cellule tumorali a causa della maggiore presenza di acquaporine e della ridotta quantità di colesterolo nelle loro membrane cellulari [ 14 , 15 ], che facilita l'accesso di RONS nella cellula. Le cellule tumorali sono anche meno efficaci nel rimuovere l'H 2 O 2 extracellulare rispetto alle cellule normali [ 16 ] (una delle principali specie reattive prodotte da CAP), aggiungendo alla selettività dei trattamenti CAP.
L'effetto citotossico dei CAP nel glioblastoma è stato principalmente dimostrato utilizzando il modello di cella monostrato bidimensionale (2D) convenzionale.Precedenti studi su cellule di glioblastoma hanno dimostrato che la PAC riduce la vitalità cellulare e induce l'apoptosi [ 17 ]. Ancor più, il trattamento con CAP riduce la clonogenicità e induce l'arresto del ciclo cellulare in cellule di glioblastoma resistenti alla temozolomide, un agente chemioterapico usato per trattare pazienti con glioblastoma [ 18 ]. Gli effetti biomedici delle CAPs sono raggiunti non solo mediante trattamento diretto, ma anche mediante l'applicazione di liquidi trattati con plasma, ricchi di specie longeve [ 19 , 20 ]. Questi studi condotti utilizzando il modello 2D monostrato, anche se informativo, non riproducono il microambiente biologico dei tumori. Recenti scoperte indicano che il microambiente tumorale svolge un ruolo chiave nella risposta al trattamento, regolando la progressione del tumore e i processi metastatici [ 21 ]. Pertanto, è possibile che le terapie sviluppate utilizzando sistemi 2D non soddisfino i requisiti per ottenere la risposta desiderata nei tumori tridimensionali (3D). Ad oggi, solo pochi studi hanno utilizzato modelli più complessi come i sistemi di coltura 3D in vitro per valutare l'effetto della PAC su diversi tipi di cancro [ 22 , 23 , 24 ] e uno studio ha testato CAP sui tumori di glioblastoma nei topi [ 25 ] .
Il getto di plasma COST è stato sviluppato come un getto di plasma standard di riferimento [ 26 , 27 ]. Il nostro gruppo ha precedentemente riportato la capacità antitumorale di questa PAC sulle colture di glioblastoma 2D [ 17 ]. Nel presente studio, abbiamo utilizzato un modello sferoide tumorale in vitro 3D che consente alle cellule di comportarsi in modo più vicino alle condizioni naturali. Il modello è più rilevante delle colture 2D poiché consente allo sferoide in vitro di sviluppare proprietà biofisiche caratteristiche dei tumori solidi (nutrienti e gradienti dell'ossigeno, accumulo di cataboliti) e la sintesi e l'assemblaggio di proteine della matrice extracellulare (ECM). In questo ambiente, le cellule nella conformazione sferoidale presentano anche gradienti di proliferazione e profili di espressione genica più vicini ai modelli clinici e in vivo [ 28 , 29 ]. Usando questo modello, abbiamo studiato la capacità del CAP di ridurre le dimensioni del tumore in sferoidi di glioblastoma in vitro. Sono stati eseguiti saggi biologici e chimici per valutare l'effetto dei trattamenti con CAP negli sferoidi di glioblastoma U87-Red e U251-Red. Abbiamo scoperto che sia le specie a breve che a lunga vita dovevano esercitare un efficace effetto inibitorio. Il nostro approccio evidenzia quindi la necessità di RONS di breve durata generati dal plasma per ridurre le dimensioni del tumore e controllare la crescita del tumore, e sottolinea l'importanza del microambiente tumorale per lo sviluppo di terapie al plasma più efficaci.
2. Risultati
2.1. Identificazione di un trattamento al plasma efficace
Lo scopo del nostro studio era di determinare l'effetto del trattamento al plasma su uno sferoide tumorale 3D in vitro. Abbiamo usato cellule fluorescenti rosse per facilitare l'identificazione delle cellule viventi. Il nucleo sferoide (parte rossa, proliferativa e vitale dello sferoide) è stato monitorato per determinare variazioni nella sua area relative all'inibizione della crescita o alla contrazione sferoidale dopo il trattamento con CAP. L'area sferoidale totale è stata misurata per valutare i cambiamenti nella dimensione sferoidale a causa della morte cellulare e della distruzione dell'architettura sferoide. La morte cellulare negli sferoidi di glioblastoma è stata monitorata usando il reagente Cytotox Green, un colorante che lega il DNA che produce un segnale fluorescente nelle cellule con una membrana cellulare danneggiata.
Abbiamo valutato per la prima volta l'effetto citotossico di un singolo trattamento al plasma diretto su glioblastoma sferoidi in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzando il getto COST con He, He + 5% H 2 O o He + 20% H 2 O secco. Nessun effetto citotossico o l'inibizione della crescita sferoidale è stata ottenuta con il plasma generato usando He o He + 5% H 2 O secco (non mostrato). Tuttavia, abbiamo osservato un ritardo nella crescita sferoidale in U87-Red e U251-Red, nonché morte cellulare in U87-sferoidi rossi trattati con jet COST He + 20% H 2 O ( informazioni supplementari, figura S1 ). Certo, questo effetto non è stato sufficiente per inibire la crescita sferoidale o per ridurre l'area del nucleo sferoide. Quindi, abbiamo somministrato un ulteriore trattamento al plasma a 24 ore.
L'esito effettivo è stato raggiunto dopo il trattamento diretto 2 × con plasma He + 20% H 2 O. In questa condizione, il plasma non solo ha inibito la crescita sferoidale, ma ha anche ridotto l'area del nucleo sferoide. Questo effetto è stato mantenuto sette giorni dopo il trattamento negli sferoidi U87-Red ( p ≤ 0,0001, Figura 1 ae Figura 2 ).Al contrario, gli sferoidi 2 × -treated con He + 5% H 2 O e il plasma He secco riducevano la loro area del nucleo sferoide, ma la crescita sferoidale riprendeva dopo 72 ore in entrambe le linee cellulari ( Figura 1 a). Lui + 5% di H 2 O e sferoidi U251-Red trattati con plasma He secchi ha dato la stessa area core dei controlli non trattati ( p ≤ 0.0001, Figura 1 a), evidenziando una risposta inferiore al trattamento al plasma.L'analisi dell'area sferoidale totale ha evidenziato valori simili per tutte le condizioni testate su entrambe le linee cellulari, ad eccezione di He + 20% H 2 O in U87-Red ( Figura 1 b). Il trattamento con CAP è stato citotossico solo quando H 2 O è stato aggiunto al gas di alimentazione ( p ≤ 0,0001, Figura 1 c), il che suggerisce la partecipazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nell'effetto biologico complessivo. Il trattamento meno efficace è stato con He secco, dove è stata osservata solo una riduzione della crescita sferoidale ma nessun effetto citotossico (livelli simili a controllo PBS non trattato, Figura 1 ). Questo potrebbe suggerire un effetto modulatorio piuttosto che un effetto citotossico del plasma He secco su cellule di glioblastoma. Abbiamo concluso che il trattamento al plasma 2 × He + 20% H 2 O ha efficacemente inibito la crescita sferoidale e ha avuto un effetto citotossico negli gliferoidi di glioblastoma U87-Red e U251-Red.
2.2. Presenza di RONS in PBS plastificato (pPBS)
Per determinare quali RONS potevano essere responsabili dell'esito biologico sopra descritto, abbiamo misurato le specie a breve e lunga vita presenti in pPBS mediante risonanza paramagnetica (EPR) e colorimetria elettronica. H 2 O 2 è stato trovato in pPBS in alte concentrazioni. La concentrazione dipendeva dalla saturazione del vapore di H 2 O del gas di alimentazione: una percentuale più alta di saturazione di H 2 O determinava più produzione di H 2 O 2 ( Figura 3 a), in accordo con il nostro rapporto precedente per questo getto di plasma [ 27 ]. Le specie a vita breve non possono essere rilevate direttamente e richiedono l'uso di trappole a spin (che reagiscono con i radicali per formare addotti radicalici più persistenti di nitrossido) [ 30 ]. Abbiamo usato 5,5-dimetil-1-pirrolina N- ossido (DMPO) per rilevare • OH e 5- (dietossifosforil) -5-metil-1-pirrolina N- ossido (DEPMPO) per O 2 • - / • OOH radicali ( figure S2 e S3 ) [ 30 , 31 , 32 ]. Gli addotti DMPO-OH e DEPMPO-OOH sono stati rilevati nell'intervallo μM. La loro concentrazione è aumentata con l'aumento del contenuto di vapore di H 2 O del gas di alimentazione ( Figura 3 b), sempre in accordo con i dati precedentemente riportati [ 27 ].
Notiamo che la concentrazione degli addotti di spin non corrispondeva alla quantità totale del radicale indotto da CAP in PBS. Tuttavia, i cambiamenti nella loro concentrazione in condizioni plasmatiche diverse corrispondevano ai cambiamenti nella quantità radicale [ 31 , 33 ]. Inoltre, la porzione di nitroxide degli addotti di spin era incline al decadimento nei liquidi trattati con plasma [ 34 ]. Il confronto diretto di diverse condizioni è possibile se la concentrazione di un addotto di spin non decompone o raggiunge un plateau piatto entro il periodo di tempo sperimentale (esposizione al plasma) [ 33 , 35 ]. Dimostriamo qui che la concentrazione di DMPO-OH è aumentata quasi linearmente entro il periodo di tempo sperimentale (fino a 4 minuti), confermando così l'applicabilità del metodo ( Figura S4 ).
La trappola di spin 2,2,6,6-tetrametilpiperidina (TEMP) è stata utilizzata per rilevare le specie di ossigeno prodotte dal plasma, come O, O 2 (a 1 Δg) e O 3 [ 31 , 33 ].L'uso di NaN 3 , un scavenger O 2 (a 1 Δg), ha permesso di determinare il contributo specifico di O 2 (a 1 Δg) alla formazione di 2,2,6,6-tetrametilpiperidina 1-ossile (TEMPO), un radicale nitrossido stabile e rilevabile mediante EPR, attraverso l'ossidazione di TEMP. Tuttavia, abbiamo rilevato solo quantità minori del TEMPO formato (inferiore a 9 μM) rispetto alle impurità nei campioni non trattati ( Figura S5 ) e non sono cambiate con la saturazione di H 2 O variata del gas di alimentazione o l'introduzione di NaN 3 (non mostrato). In precedenza, abbiamo dimostrato una degradazione del plasma molto efficiente dei derivati TEMPO [ 34 ]. Quindi, attribuiamo l'effetto osservato a due fattori: (1) basse concentrazioni di O / O 2 (a 1 Δg) / O 3 prodotte dal plasma in presenza di vapore acqueo [ 31 ]; e (2) rapida degradazione del TEMPO formato da radicali • OH che sono presenti in alte concentrazioni (vedi Figura 3 b).
Abbiamo anche tentato di rilevare • NO radicali usando N-metil- d- glucammino ditiocarbammato (MGD) -iron (II) complesso ((MGD) 2 Fe 2+ ) e 2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina 1 spin spin di ossido di 3-ossido (PTIO), come descritto nella Sezione 4.8 (vedere Mat. e Met.). In tutte le condizioni del plasma, nessun • NO è stato rilevato. Questi risultati concordano con le basse concentrazioni di altre specie di azoto reattivo (RNS) misurate (longeva) indotte da CAP in pPBS ( Figura 3 c).
Quindi, possiamo provvisoriamente attribuire gli effetti biologici della PAC alle seguenti specie: • OH, O 2 • - / • OOH, H 2 O 2 , NO 2 - / NO 3 - . Riconosciamo che altre specie interessate dal plasma biologicamente rilevanti come ClO - [ 36 ], ONOO -[ 37 , 38 ] e OONOO - [ 39 ] potrebbero essere presenti in pPBS, ma queste non sono state monitorate in questo studio. Tuttavia, è probabile che le ultime due specie siano presenti in basse concentrazioni (se presenti), come tutti gli altri RNS rilevati e ClO - si formano in grandi quantità, principalmente in presenza di specie di ossigeno come l'ossigeno atomico [ 36 ].
2.3. Determinazione del ruolo delle specie a breve e lunga vita nel plasma sulla vitalità sferoidale
Per determinare se l'effetto biologico osservato fosse dovuto solo alle specie longeve o alla combinazione di specie a breve e lunga vita prodotte dalla PAC, abbiamo valutato l'effetto di: (1) trattamento plasma diretto 2 ×; (2) 2 × trattamento al plasma indiretto (2 × pPBS); e (3) 2 × RONS si mescolano in PBS (con le stesse concentrazioni delle specie longeve H 2 O 2 e NO 2 - come nel pPBS usato) su gliferoblasti di glioblastoma. NO 2 - può subire un'ulteriore ossidazione nel liquido per ottenere NO 3- [ 40 ]. Quindi, abbiamo usato NO 2 - nella concentrazione corrispondente alla quantità combinata di NO 2 - e NO 3 - . Riconosciamo che la concentrazione effettiva di NO 2 - indotta in PBS da CAP potrebbe essere stata inferiore.
I trattamenti 2 × con miscela pPBS o RONS erano meno efficaci del trattamento diretto 2 × nell'inibizione della crescita sferoidale in entrambe le linee cellulari di glioblastoma, specialmente in U87-Red ( p ≤ 0.0001; Figura 2 e Figura 4 a). Il trattamento diretto ha indotto la contrazione sferoidale in U87-Red che è stata mantenuta per l'intera durata dell'esperimento, mentre la crescita sferoidale è ripresa dopo 72 ore negli sferoidi esposti a 2 × pPBS e 2 × RONS mix. Sebbene il trattamento al plasma diretto 2 × non fosse in grado di inibire completamente la crescita sferoidale U251-Red ( Figura 4 a), è stata osservata una differenza statisticamente significativa tra questo trattamento e le altre due condizioni testate qui ( p ≤ 0,001 at t = 168 h) .Quindi, concludiamo che il trattamento al plasma diretto 2 × era più efficiente rispetto al mix 2 × pPBS e RONS nell'inibire la crescita sferoidale.
In entrambe le linee cellulari, gli sferoidi esposti alla miscela 2 × RONS hanno mostrato una maggiore area sferoidale rispetto al controllo non trattato ( Figura 4b). In U87-Red, questo è stato osservato anche in sferoidi 2 × pPBS trattati. Questo effetto potrebbe essere spiegato dal distacco cellulare di cellule morte dal nucleo sferoide che si aggiunge alla superficie sferoidale totale ( Figura 4 c). Tuttavia, abbiamo osservato che l'elevata citotossicità del trattamento diretto 2 × ( Figura 4 c) non era correlata con un aumento dell'area sferoidale totale ( Figura 4 b). Pertanto, sembra che il trattamento diretto 2 × sia stato in grado non solo di inibire la crescita sferoidale e uccidere le cellule cancerose come mostrato qui, ma anche di limitare il distacco cellulare delle cellule morte e del tessuto sferoide dal nucleo sferoide. Sebbene riconosciamo la partecipazione delle specie longeve presenti in pPBS e nel mix RONS, i nostri risultati indicano che le specie a vita breve erogate dal plasma durante il trattamento diretto 2 × sono necessarie per inibire completamente la crescita sferoidale in U87-Red e per ritardarlo in U251-Red.
2.4. I trattamenti diretti al plasma 2 × hanno inibito la migrazione cellulare
Gli glioblastomi sono caratterizzati dalla loro alta natura migratoria, che consente loro di metastatizzare nei tessuti cerebrali circostanti [ 1 ]. Abbiamo studiato la capacità del nostro trattamento al plasma altamente citotossico (trattamento plasma 2 ×, He + 20% H 2 O) per inibire la migrazione delle cellule che sopravvivono al trattamento. I nostri risultati hanno dimostrato che il trattamento al plasma diretto 2 × ha ridotto la migrazione cellulare ( Figura 5 a, b). Il trattamento diretto 2 × ha avuto un effetto significativo su entrambe le linee cellulari, con migrazione cellulare minima o nulla 24 ore dopo il trattamento ( p ≤ 0,0001) e una migrazione impedita in cellule U87-Red 48 ore dopo il trattamento ( p ≤ 0,0001; Figura 5 a, b). Questo effetto è stato mantenuto 72 ore dopo il trattamento solo negli sferoidi U251-rossi ( p ≤ 0,0001).L'inibizione della migrazione delle cellule inferiori è stata osservata in sferoidi 2 × pPBS- e RONS miscelati con la miscela in tutti i momenti (tranne dopo 48 ore per U87-Red e 72 h per entrambe le linee cellulari). Abbiamo osservato i cambiamenti morfologici negli sferoidi durante il trattamento al plasma, in particolare il restringimento del nucleo sferoide e la presenza di cellule morte attorno ad esso ( Figura 5 c). Mentre gli sferoidi di controllo presentavano un modello di migrazione omogeneo con cellule che si espandevano in tutte le direzioni attorno al nucleo sferoide, il modello era asimmetrico in sferoidi trattati con plasma con un numero ridotto di cellule migratorie. Ciò potrebbe essere dovuto alla quantità di cellule morte nello strato esterno dello sferoide. Le differenze osservate tra le dinamiche di migrazione di entrambe le linee cellulari potrebbero anche indicare diverse strategie di sopravvivenza.
Sulla base di questi risultati, abbiamo concluso che il trattamento al plasma diretto 2 × ha inibito efficacemente la capacità migratoria degli sferoidi U87-Red e U252-Red e questo trattamento era più efficiente rispetto al mix di pPBS e RONS. Pertanto, la combinazione di specie a vita breve fornite dalla PAC è necessaria per ridurre efficacemente la migrazione cellulare negli sferoidi di glioblastoma.
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